1919年12月1日（农历己未年十月初十日）她出身在清贫的家庭。七岁丧父。
1929年进当地醒狮剧艺社学艺，学花旦。可是所投的科班两次解散，后考进嵊县华堂镇大华舞台。
1933年冬她离开科班，与别人搭班在浙东的宁波、绍兴、杭州一带演出。
1934年年底，沈家门一个戏班请新凤舞台出身的叶彩金唱头肩旦，聘刚从瑞云舞台满师的竺水招唱二肩旦，唯独缺少小生，这位班主听说尹桂芳旦角、生角兼能，于是一边托人来聘请，一边自作主张地将尹桂芳取名为“尹云峰”，挂出了牌子。尹桂芳到了沈家门，一见此状，哭笑不得。由花旦改演小生，谁知用“尹云峰”的名字扮演小生，竟使她成了名。
1935年正式在沈家门登台，这以后，尹桂芳跟随多个演出班子，辗转演出于新昌、嵊县、宁波、杭州等地。
1938年尹桂芳正式进军大上海，加盟了旧上海老闸桥旁的永乐戏院，後在同乐戏院领衔演出。那个时期，正是上海越剧由花旦台柱向小生台柱过渡的时期。
1940年秋，尹桂芳与竺水招合作挂头牌。
1941年，《吕布与貂蝉》。
1942年6月，尹桂芳与来自四季春班的傅全香在老闸大戏院演出了《黄金与美人》、《春花泣秋风》等新戏。
1945年春，她聘请洪钧、徐进、弘英、兰明等先后编演了《石达开》、《夜短情长》、《宝玉与黛玉》、《春闺梦里人》、《几时重相见》、《荒岛恩仇记》、《沙漠王子》等新戏，影响进一步扩大。尤其是《宝玉与黛玉》中的《宝玉哭灵》和《沙漠王子》中的《算命》唱段，在电台播唱后，听众反响强烈，越剧改革取得了一定的交果。这时尹桂芳的演技也日臻成熟，逐渐形成了自己的风格与流派。
1946年，她与竺水招搭档成立芳华越剧团，任团长。长期演出于境内贵州路丽都大戏院，先后演出了《云破月圆》、《殉情》、《石达开》、《葛嫩娘》、《光绪与珍妃》等一大批既有思想内涵又能吸引观众的新戏，尤其是《宝玉与黛玉》、《沙漠王子》和时装戏《回头想》、《秋海棠》、《浪荡子》等戏，接二连三地引起轰动。由于她艺德出众、人品高尚，越剧姐妹们都亲切地称她为“尹大姐”。
1947年，她积极支持袁雪芬倡导的《山河恋》义演活动，放弃了自己原定拍摄电影《王孙公子》的计划。
1948年，先后与傅全香、王文娟搭档，在兰心和新光两家剧场主演了《陆文龙》、《浪淘沙》、《鲁男子》、《桃花扇》等新戏。越剧观众投票选举“越剧皇帝”，色艺双绝、德艺双馨的尹桂芳荣登榜首。
1951年，在大众剧场义演《杏花村》，为抗美援朝捐献"越剧号"飞机作出贡献。
1952年在丽都大戏院排演了古典名剧《西厢记》和新编历史剧《信陵君》、《陈胜吴广》，《梁祝哀史》等。
1954年，华东戏曲汇演，她主演的《屈原》获得剧本、表演、音乐一等奖。
1955年当选为上海市人民代表。
1958年，在现代剧《红花村》中扮演先进的服务员，产生了不小的社会反响。
1959年起为福州市人民代表。
1959年1月25日，尹桂芳率“芳华越剧团”全体演职员六十三人，登上了从上海开往福州的第53次列车。她怀着一股热情，毅然举团迁往福建，到八闽之地去继续播撒越剧艺术的种子。尹桂芳曾在《红楼梦》、《西厢记》、《沙漠王子》、《盘妻索妻》、《屈原》、《梁山伯与祝英台》剧目中成功地塑造了贾宝玉、张生、梁玉书、梁山伯、屈原、等人物形象，给人留下难忘的印象。芳华越剧团在尹桂芳的领导下，培养出一批“尹派后秀”，在历届省戏剧会演中，均获奖。
1960年加入中国共产党。
1963年起，任福建省政协委员。
文化大革命期间，由于常年处于极其恶劣的生活环境中，加之以一些非人待遇对身体所造成的侵害，尹桂芳倒下了，中枢神经损伤，一手一足瘫痪。身残志不残，仍然为振兴越剧事业，培养越剧新人积极地贡献自己的力量。粉碎“四人帮”后，尹桂芳带病恢复了“芳华”。
1978年当选为全国文联委员，并任中国戏剧家协会福建分会副主席。现任福建省政协委员、芳华越剧团名誉团长。
1979年处于半瘫痪中的尹桂芳，在上海艺术研究所和上海越剧院的帮助下，举办了盛况空前的"尹桂芳越剧流派演唱会"。这一天，她重新登台，与袁雪芬一起，唱起了《山河恋》的"送信"选段。容纳一万多人的文化广场座无虚席。她将更多的精力投入到了培养尹派接班人的工作中去，是尹桂芳艺术生命的延续，用她自己的话说：残了尹桂芳，自有后来人。 1986年芳华越剧团在福州举行规模庞大的建团40周年大会及尹派艺术演唱会。
1990年12月10至17日，芳华越剧团首次应邀出访香港，演出了《红楼梦》、《玉蜻蜓》、《何文秀》等优秀剧目，香港同胞首次欣赏到芳华的艺术风采。
2000年3月1日上午08：15分，尹桂芳走了，但她却留下一笔闪光的越剧艺术遗产。
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